琼脂糖凝胶电泳检测DNA 琼脂糖( 二 )

② 琼脂脂糖的浓度如下表所示，不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。
表琼脂糖浓度与DNA分离范围琼脂糖浓度/%0.30.60.70.91.21.52.0线状DNA大小/kb60-520-110-0.87-0.56-0.44-0.23-0.1
2、核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系
不同构型DNA的移动速度次序为：供价闭环DNA(covalently closed circular ， cccDNA)直线DNA开环的双链环状DNA 。当琼脂糖浓度太高时，环状DNA(一般为球形)不能进入胶中，相对迁移率为0(Rm=0) ，而同等大小的直线双链DNA(刚性棒状)则可以长轴方向前进(Rm0) ，由此可见，这三种构型的相对迁移率主要取决于凝胶浓度，但同时，也受到电流强度、缓冲液离子强度等的影响。
3、电泳方法
① 凝胶类型
用于分离核酸的琼脂糖凝胶电泳可分为垂直型及水平型(平板型) 。水平型电泳时，凝胶板完全浸泡在电极缓冲液下1-2mm ，故又称为潜水式。目前更多用的是后者，因为它制胶和加样比较方便，电泳槽简单，易于制作，又可以根据需要制备不同规格的凝胶板，节约凝胶，因而较受欢迎。
② 缓冲液系统
缺少离子时，电流太小， DNA迁移慢;相反，高离子强度的缓冲液由于电流太大会大量产热，严重时，会造成胶熔化和DNA的变性。
常用的电泳缓冲液有EDTA(pH8.0)和Tris-乙酸(TEA) ， Tris-硼酸(TBE)或Tris-磷酸(TPE)等，浓度约为50mmol/L(pH7.5~7.8) 。电泳缓冲液一般都配制成浓的贮备液，临用时稀释到所需倍数。
TAE缓冲能力较低，后两者有足够高的缓冲能力，因此更常用。TBE浓溶液长期贮存会出现沉淀，为避免此缺点，室温下贮存5×溶液，用时稀释10倍0.5×工作溶液即能提供足够缓冲能力。
③ 凝胶的制备
以稀释的电极缓冲液为溶剂，用沸水浴或微波炉配制一定浓度的溶胶，灌入水平胶框或垂直胶膜，插入梳子，自然冷却。
④ 样品配制与加样
DNA样品用适量Tris-EDTA缓冲液溶解，缓冲液内含有0.25%溴酚蓝或其他指示染料，含有10%-15%蔗糖或5%~10%甘油，以增加其比重，使样品集中。为避免蔗糖或甘油可能使电泳结果产生U形条带，可改用2.5%Ficoll(聚蔗糖)代替蔗糖或甘油。
⑤ 电泳
琼脂糖凝胶分离大分子DNA实验条件的研究结果表明，在低浓度、低电压下，分离效果较好。在低电压条件下，线性DNA分子的电泳迁移率与所用的电压呈正比。但是，在电场强度增加时，较大的DNA片段迁移率的增加相对较小。因此随着电压的增高，电泳分辨率反而下降，为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不宜高于5V/cm 。
电泳系统的温度对于DNA在琼脂糖凝胶中的电泳行为没有显著的影响。通常在室温下进行电泳，只有当凝胶浓度低于0.5%时，为增加凝胶硬度，可在4℃进行电泳。
⑥ 染色和拍照
常用荧光染料溴乙锭(EB)染色，在紫外光下观察DNA条带，用紫外分析仪拍照，或用凝胶成像系统输出照片，并进行有关的数据分析。
注意事项：电泳中所使用的染料EB是致癌物质，一定要小心，避免其接触皮肤等，进行电泳操作的时候一定要带手套，手套要及时更换，现在也除了一些EB的替代物，如Goldview等。
琼脂糖和琼脂有什么不同1、成分不同
琼脂糖是线性的多聚物，基本结构是1,3连结的β-D-半乳糖和1,4连结的3,6-内醚-L-半乳糖交替连接起来的长链。琼脂果胶是由许多更小的分子组成的异质混合物。
琼脂是由海藻中提取的多糖体，是目前世界上用途最广泛的海藻胶之一。
2、特点不同
琼脂糖在水中一般加热到90℃以上溶解，温度下降到35-40℃时形成良好的半固体状的凝胶，这是它具有多种用途的主要特征和基础。琼脂糖凝胶性能通常用凝胶强度表示。强度越高，凝胶性能越好。
琼脂是植物胶的一种，常用海产的麒麟菜、石花菜、江蓠等制成，为无色、无固定形状的固体，溶于热水。在食品工业中应用广泛，亦常用作细菌培养基。

琼脂糖凝胶电泳检测DNA 琼脂糖( 二 )

秒懂生活扩展阅读