PCR引物浓度引物浓度

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qPCR扩增曲线和熔解曲线
一、扩增曲线形状异常
1、扩增曲线不光滑：信号太弱，经系统矫正后产生。提高模板浓度重复实验。
2、扩增曲线断裂或下滑：模板浓度较高，基线的终点值大于Ct值。减小基线终点（Ct值-4），重新分析数据。
3、个别扩增曲线突然骤降：反应管内留有气泡。处理样本时要注意离心．进行扩增反应之前要仔细检查反应管内是否有气泡残留。
二、反应结束无扩增曲线出现
1、反应循环数不够：一般设置循环数为40．但需要注意的是过多的循环会增加过多的背景信号，降低数据可信度。
2、确认程序中是否设置了信号采集步骤：两步法扩增程序一般将信号采集设置在退火延伸阶段；三步法扩增程序应当将信号采集设置在72℃延伸阶段。
3、确认引物是否降解：长时间末用的引物应先通过PAGE电泳检测完整性，以排除其降解的可能。
4、模板浓度过低：减少稀释度重复实验，一般未知浓度的样品先从最高浓度做起。
5、模板降解：重新制备模板，重复实验。
三、CT值较大
1、扩增效率极低：优化反应条件，尝试三步法扩增程序，或者重新设计合成引物。
2、模板浓度过低：减少稀释度重复实验，一般未知浓度的样品先从最高浓度做起。
【PCR引物浓度引物浓度】3、模板降解：重新制备模板，重复实验。
4、PCR产物过长：推荐PCR产物长度为80-150 bp 。
5、体系中存在PCR抑制剂：一般为模板带入，加大模板稀释倍数或者重新制备模板重复实验。
四、阴性对照出现明显扩增
1、反应体系污染：更换新的Master Mix、水、引物重复实验。反应体系在超净工作台内配制，减少气溶胶污染。
2、引物二聚体的出现：配合解曲线进行分析。
五、绝对定量时标准曲线线性关系不佳
1、加样误差：提高模板稀释倍数，提高加样体积。
2、标准品降解：重新制备标准品，重复实验。
3、模板浓度过高：提高模板稀释倍数。
六、溶解曲线出现多峰
1、引物设计不优：根据设计原则设计合成新的引物。
2、引物浓度过高：适当降低引物浓度。
3、cDNA模板带有基因组污染：重新制备cDNA模板
七、实验重复性差
1、加样体积失准：使用性能较好的移液枪；将模板做高倍稀释，以大体积加入反应体系中。
2、定量PCR仪不同位置温度控制不一致：定期校准仪器。
3、模板浓度过低：模板浓度越低．重复性越差．减少模板稀释度或提高加样体积。

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