氯仿的化学名称氯仿

碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0~12.5这个狭窄的范围内,线性的DNA双螺旋结构解开而被变性,尽管在这样的条件下,共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂,但两条互补链彼此相互盘绕,仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复Ph至中性时，共价闭合环状质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，在而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
[实验仪器与设备]
1.恒温培养箱
2.恒温摇床
3.台式离心机(最大转速4000rpm)
4.冷冻高速离心机
5.高压灭菌锅
6.超净工作台
7.微量移液器8.eppendorftupe、tip
[实验材料]
1.葡萄糖
2.三羟甲基氨基甲烷(Tris)
3.乙二胺四乙酸(EDTA)
4.氢氧化钠
5.十二烷基硫酸钠(SDS)
6.乙酸钾
7.冰乙酸
8.氯仿
9.乙醇
10.胰RNA酶
11.氨苄青霉素
12.蔗糖
13.溴酚蓝
14.酚
15.β巯基乙醇
16.盐酸
17.含pUC18质粒的大肠杆菌
附：试剂的配制
1.溶液Ⅰ
50mmol/L葡萄糖
5mmol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)Tris·HCl(pH8.0)
10mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)(pH8.0)
2.溶液Ⅱ
0.4mol/L NaOH,2%SDS,用前等体积混合
3.溶液Ⅲ
5mmol/L乙酸钾60ml
冰乙酸11.5ml
水28.5ml
4.TE缓冲液
10mmol/L Tris·HCl
1mmol/l EDTA(pH8.0)
5.70%乙醇(放-20℃冰箱中,用后即放回)
6.胰RNA酶
将RNA酶溶于10mmol/L Tris·HCl(pH7.5)、15mmol/L NaCl中，配成10mg/ml的浓度，于100℃加热15min,缓慢冷却至室温，保存于-20℃ 。
7.终止液:40%蔗糖、0.25%溴蓝酚
8.酚
[实验步骤]
(一)提取质粒
1.将2ml含相应抗生素的LB液体培养基加入到试管中，接入含质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。
2.取1.5ml培养物倒入微量离心管中，4000rpm，离心2min 。
3.吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。
4.将细菌沉淀悬浮于100μl溶液Ⅰ中，充分混匀，室温放置10min 。
5.加200μl溶液Ⅱ(新鲜配制)，混匀内容物，将离心管放冰上5min 。
6.加入150μl溶液Ⅲ(冰上预冷)，盖紧管口，颠倒数次使混匀。
7.1200rpm，离心15min，将上清转至另一离心管中。
8.向上清中加入等体积酚：氯仿(去蛋白)，反复混匀，12000rpm，离心5min,将上清转移到另一离心管中。
9.向上清加入2倍体积乙醇,混匀后,室温放置5-10min 。12000rpm离心5min 。倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。
10.用1ml70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或空气中干燥。
11.加50μL TE缓冲液，其中含有20μg/ml的胰RNA酶，使DNA完全溶解，-20℃保存。
琼脂糖凝胶电泳检测DNA
【氯仿的化学名称氯仿】琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的常用方法。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。不同浓度琼脂糖凝胶可以分离从200bp至50kb的DNA片段。在琼脂糖溶液中加入低浓度的溴化乙锭(ethidumbromide,EB)，在紫外光下可以检出10ng的DNA条带，在电场中，pH8.0条件下，凝胶中带负电荷的DNA向阳极迁移。
琼脂糖凝胶有如下特点：
(1)DNA的分子大小在凝胶基质中其迁移速率与碱基对数目的常用对数值成反比，分子越大迁移得越慢。
(2)琼脂糖浓度一个特定大小的线形DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率(u)的对数与凝胶浓度(t)成线性关系。
(3)电压低电压时，线状DNA片段迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm 。
(4)电泳温度DNA在琼脂糖凝胶电泳中的电泳行为受电泳时的温度影响不明显，不同大小的DNA片段其相对迁移速率在4℃与30℃之间不发生明显改变，但浓度低于0.5%的凝胶或低熔点凝胶较为脆弱，最好在4℃条件下电泳。

氯仿的化学名称 氯仿

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