氯仿的化学名称氯仿( 二 )

(5)嵌入染料荧光染料溴化乙锭用于检测琼脂糖凝胶中的DNA，染料嵌入到堆积的碱基对间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强,还会使线状迁移率降低15% 。
(6)离子强度电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶，电导率最小，DNA几乎不移动，在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液)，则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化。
对于天然的双链，常用的几种电泳缓冲液有TAE、TBE等，一般配制成浓缩母液，室温保存，用时稀释。
[实验仪器与设备]
1.恒温培养箱
2.琼脂糖凝胶电泳系统
3.高压灭菌锅
4.紫外线透射仪
[实验材料]
1.三羟甲基氨基甲烷(Tris)
2.硼酸
3.乙二胺四乙酸(EDTA)
4.溴酚蓝
5.蔗糖
6.琼脂糖
7.溴化乙锭
8.DNAmarker
9.DNA样品
[实验步骤]
1.缓冲液的配制
①5×TBE(5倍体积的TBE贮存液)
配1000ml5×TBE:
Tris54g
硼酸27.5g
0.5mol/l EDTA 20ml
Ph8.0
②凝胶加样缓冲液(6×)
溴酚蓝0.25%
蔗糖40%
③溴化乙锭溶液(EB)0.5μg/ml
2.制备琼脂糖凝胶
按照被分离DNA的大小,决定凝胶中琼脂糖的百分含量。可参照下表：
琼脂糖凝胶浓度线性DNA的有效分离范围
0.3% 5-60kb
0.6% 1-20kb
0.7% 0.8-10kb
0.9% 0.5-7kb
1.2% 0.4-6kb
1.5% 0.2-4kb
2.0% 0.1-3kb
3.胶板的制备
(1)用高压灭菌指示纸带将洗静、干燥的玻璃板的边缘(或电泳装置所皿备的塑料盘的开口)封住，形成一个胶膜(将胶膜放在工作台的水平位置上，用水平仪校正) 。
(2)配制足够用于灌满电泳槽和制备凝胶所需的电泳缓冲液(1×TBE) 。准确称量的琼脂糖粉。缓冲液不宜超过锥瓶或玻璃瓶的50%容量。在电泳槽和凝胶中务必使用同一批次的电泳缓冲液，离子强度或pH值的微小差异会在凝胶中形成前沿，从而大大影响DNA片段的迁移率。
(3)在锥瓶的瓶颈上松松地包上一层厚纸。如用玻璃瓶，瓶盖须拧松。在沸水浴或微波炉中将悬浮加热至琼脂糖溶解。注意：琼脂糖溶液若在微波炉里加热过长时间，溶液将过热并暴沸。应核对溶液的体积在煮沸过程中是否由于蒸发而减少，必要时用缓冲液补充。
(4)使溶液冷却至60℃ 。加入溴化乙锭(用水配制成10mg/ml的贮存液)到终浓度为0.5ug/ml，充分混匀。
(5)用移液器吸取少量琼脂糖溶液封固胶模边缘，凝固后，在距离底板0.5-10mm的位置上放置梳子，以便加入琼脂糖后可以形成完好的加样孔。如果梳子距玻璃板太近，则拔出梳子时孔底将有破裂的危险，破裂后会使样品从玻璃板之间渗透。
(6)将剩余的温热琼脂糖溶液倒入胶模中。凝胶的厚度在3-5mm之间。检查一下梳子的齿下或齿间是否有气泡。
(7)在凝胶完全凝固后(于室温放置30-45分钟)，小心移去梳子和高压灭菌纸带，将凝胶放入电泳槽中。
低熔点琼脂糖凝胶及浓度低于0.5%的琼脂糖凝胶应冷却至4℃，并在冷库中电泳。
(8)加入恰好没过胶面约1mm深的足量电泳缓冲液。
4.加样
DNA样品与所需加样缓冲液混合后，用微量移液器，慢慢将混合物加至样品槽中。此时凝胶已浸没在缓冲液中。一个加样孔的最大加样量依据DNA的数量及大小而定，一般为20-30μl样品。
已知大小的DNA标准，应同时加在凝胶的左凝胶的左侧和右侧孔内。确定未知DNA的大小。测量未知DNA的大小时，要所有样品都用相同的样品缓冲液。
5.电泳
在低电压条件下,线形DNA片段的迁移速度与电压成比例关系,但是,在电场增加时,不同相对分子质量的DNA片段泳动度的增加是有差别的。因此，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围随之减小。为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不应高于5V/cm 。当溴酚蓝指示剂移到到距离胶板下沿约1-2cm处，停止电泳。

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