聚合酶链式反应的英文缩写是聚合酶链式反应( 四 )

纯化的Taq酶在体外无3'5'外切酶活性，因而无校正阅读功能，在扩增过程可引起错配。错配堿基的数量受温度、Mg2+浓度和循环次数的影响。通常，30次循环Taq酶的错配率约为0.25％，高于Klenow酶的错配率。Taq酶在每一次循环中产生的移码突变率为1/30000，堿基替换率为1/8000 。应用低浓度的dNTP（各20μmol／L）、1.5mmol/L的Mg2+浓度、高于55℃的复性温度，可提高Taq酶的忠实性，此时的平均错配率仅为5x10^6次/（核苷酸*循环）。
Taq酶具有类似于末端转移酶的TdT的活性，可在新生成的双链产物的3'端加上—个堿基，尤其是dATP最容易加上。因此，欲将PCR产物克隆到载体上，可以用两种处理办法：一是构建dT载体；二是用Klenow酶将3'端的A去掉，即在PCR反应后，先在99℃加热10min灭活Taq酶，调整Mg2+浓度至510mmol/L，加入12U Klenow片段，室温下作用1520min，3'端的A即被切去，
Taq酶还具有反转录活性。在23mmol/L Mg2+浓度下68℃时出现类似反转录酶的活性。若有Mg2+存在，则反转录活性更佳，利用这一活性，可直接用于RNAPCR，尤其是短片段的扩增。
以往用Taq酶进行PCR扩增，一般只能扩增小于400bp的DNA片段，经过对酶的结构与功能的改造，以及PCR方法学的改进，现已能扩增20kb以上的DNA分于。
Taq酶在PCR反应中加入的量也很重要，太少当然不好，太多一方面浪费，同时也导致非特异性扩增，通常每lOOμl反应液中含12.5U Taq酶为好。最好在0.55U范围内确定最佳酶浓度。另一个问题是，虽然Taq酶是热稳定性较好的工具酶，也应注意在20℃贮存。
（四）缓冲液
缓冲液提供PCR反应合适的酸堿度与某些离子，常用1050mmol/L 。TrisHCI（pH8.38.8）缓冲液。缓冲液中含有50mmol/L KCl有利于引物的退火。有人并加入小牛血清白蛋白（100μg/L）或明胶（0.0％）或Twen20（0.05％0.1％）或二硫基苏糖醇（DDT，5mmol/L）等，认为这些物质可以保护Taq酶。
（五）Mg2+Taq酶的活性需要Mg2+ 。Mg2+浓度过低，Taq酶活力显暑降低；Mg2+浓度过高，又使酶催化非特异性扩增。Mg2+浓度还影响引物的退火、模板与PCR产物的解链温度、引物二聚体的生成等。Taq酶的活性只与游离的Mg2+浓度有关，而PCR反应体系中，dNTP、引物、DNA模板等中的所有磷酸基团均可与Mg2+结合而降低Mg2+的游离浓度。因此，Mg2+的总量应比dNTP的浓度高0.20.25mmol/L 。如果反应体系中含有EDTA等螯合剂，也可结合掉一部分Mg2+ 。
为了获得Mg2+的最佳浓度，可用下面的优化法。首先在PCR缓冲液小不加入Mg2+，从配置的10mmol/L的Mg2+储存液中取一定量加入到各反应管中，开始以0.5mmol/L的浓度梯度递增（0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,……5.0mmol/L），由PCR反应后的电泳结果可确定Mg2+大概浓度范围，再在该浓度的上下以0.2mmol/L递增与递减几个浓度来精确确定Mg2+最适浓度。
（六）dNTP
dNTP为PCR反应的合成原料。每种dNTP浓度应相等，通常的浓度范围为20200gmol/L，在此范围内，PCR产物的量、反应的特异性与忠实性之间的平衡最佳。例如，当每种dNTP为20μmol/L时，理论上可以产生2.6μg的400bp的DNA 。使四种dNTP的浓度保持在其Km值（1015μmol/L）以上，可保持堿基掺入的忠实性；若dNTP的浓度大于50mmol/L，则可抑制Taq酶的活性。
（七）反应温度和循环次数
1．变性温度与时间
PCR反应中变性这一步很重要，若不能使模板DNA和PCR产物完全变性，PCR反应就不能成功，DNA分子中G+C含量愈多，要求的变性温度愈高。太高的变性温度和时间又会影响Taq酶的活性，通常的变性温度和时间分别为95℃、30s，有时用97℃、15s 。虽然DNA链在变性温度时两链分离只需几秒钟，但反应管内部达到所需温度还需要一定的时间，团此要适当延长时间。为了保证模板DNA能彻底变性．最好为710min，然后在以后的循环中，将变性步骤设为95℃/min 。
扩增100300bp短片段时，还呵以用快速的两步PCR法，即变性（9497℃）、退火及延长（5575℃）。
【聚合酶链式反应的英文缩写是聚合酶链式反应】 为防止在变性温度时反应液的蒸发，可在反应管内加入12滴液体石蜡。
2．复性温度和时间
复性温度决定PCR的特异性，合适的复性温度应低于引物Tm值的5℃ 。退火温度过低，引起非特异性扩增；增高退火温度，可提高扩增的特异性，因此要严格规定退火温度。退火反应时间一般为1min 。
在PCR开始的头一次循环时，反应从远低于Tm值的温度开温，由于Taq酶在低温时仍具有活性，这时就可能因引物与模板非特异性配对面出现非特异性产物或出现引物二聚体然后在以后整个PCR反应中，非特异性产物反复扩增，而使PCR严重失败。为了尽量消除这种非特异性扩增，可以使用热起动的方式，热起动方法有几种：一种方法是在PCR系统中加入抗Taq酶抗体。抗体与Taq酶结合，使Taq酶活性受抑制。因此在开始时，虽然温度低，引物可与与模板错配，但因Taq酶没有活性，不会引起非特异性扩增；当进行热变性时，抗体在高温时失活，Taq酶被释放，就可发挥作用，在以后的延伸步骤进行特

聚合酶链式反应的英文缩写是 聚合酶链式反应( 四 )

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