聚合酶链式反应的英文缩写是聚合酶链式反应( 三 )

法医：犯罪现场标本分析；HLADQ
肿瘤：胰癌、结肠癌、肺癌、甲状腺癌、黑色素瘤、血液恶性肿瘤
组织和群体生物学：遗传聚类研究；动物保护研究；生态学；环境科学；实验遗传学。
古生物学：考古与博物馆标本分析
动物学：动物传染病的诊断等
植物学：检测植物病原等
8PCR的基本原理和概念8.1基本原理
DNA在细胞中的复制是—个比较复杂的过程。参与复制的基本因素有：DNA聚合酶、DNA连接酶、DNA模板、由引发酶合成的RNA引物、核苷酸原料、无机离子、合适的pH、以及解开DNA的超螺旋及双螺旋等结构的若干酶与蛋白质因子等。
PCR是在试管中进行DNA复制反应，基本原理与体内相似，不同之处是耐热的Taq酶取代DNA聚合酶，用合成的DNA引物替代RNA引物，用加热（变性）、冷却（退火、保温（延伸）等改变温度的办法使DNA得以复制，反复进行变性、退火、延伸循环，就可使DNA无限扩增。PCR的具体过程如下：
将PCR反应体系升温至95℃左右，双链的DNA模板就解开成两条单链，此过程为变性。然后将温度降至引物的Km值以下，3'端与5'端的引物各自与两条单链DNA模板的互补区域结合，此过程称为退火。当将反应体系的温度升至70℃左右时，耐热的Taq DNA聚合酶催化四种脱氧核糖核苷酸按照模板DNA的核苷酸序列的互补方式依次加至引物的3'端，形成新生的DNA链。每一次循环使反应体系中的DNA分子数增加约一倍。理论上循环几次，就增加为2^n倍。当经30次循环后，DNA产量达2^30拷贝，约为10^9个拷贝。PCR扩增过程见图81 。由于实际上扩增效率达不到2倍，因而应为（1+R）^n，R为扩增效率。
8.2参与PCR反应体系的因素及其作用
参与PCR反应的因素主要包括模板核酸、引物、TaqDNA聚合酶、缓冲液、Mg2+、三磷酸脱氧核苷酸（dNTP）、反应温度与循环次数、PCR仪等。现对它们的作用介绍如下：
（一）模板核酸
用于PCR的模板核酸可以是DNA，也可以是RNA 。当用RNA作模板时，首先要进行反转录生成cDNA，然后再进行正常的PCR循环。核酸模板来源广泛，可以从培养细胞、细菌、病毒、组织、病理标本、考古标本等中提取。
PCR反应时加入的DNA模板量一般为100100000拷贝，现在的技术水平已能从单个细胞制备出相应的cDNA文库。DNA模板含量合适，可以减少PCR多次循环带来的堿基错配。
通常模板DNA用线性DNA分子，若为环状质粒，最好先用酶将其切开成线状分子，因为环状DNA复性太快。
（二）引物
引物决定PCR扩增产物的特异性与长度。因此，引物设计决定PCR反应的成败。
PCR反应中有两种引物，即5'端引物与3'端引物。5'端引物是指与模板5'端序列相同的寡核苷酸，3'端引物是指与模板3'端序列互补的寡核苷酸。对引物的基本要求有：①引物的长度过短会影响PCR的特异性，要求有1630bp，因为4^164.29x10^9，已大于哺乳动物基因组3x10^9bp，保证了特异性结合；引物过长使延伸温度超过Taq DNA聚合酶的最适温度（74度），亦会影响产物的特异性。②G+C的含量一般为40％60％。③四种堿基应随机分布，不要有连续3个以上的相同嘌吟或嘧啶存在。尤其是引物3'端，不应有连续3个G或c，否则会使引物与核酸的G或c富集区错误互补，而影响PCR的特异性。④引物自身不应存在互补序列而引起自身折叠，起码引物自身连续互补堿基不能大于3bp 。⑤两引物之间不应互补，尤其是它们的3'端不应互补。一对引物之间不应多于4个连续堿基有互补性，以免产生引物二聚体。④引物与非特异靶区之间的同源性不要超过70％或有连续8个互补堿基同源，否则导致非特异性扩增。①引物3'端是引发延伸的点。因此不应错配。由于ATCG引起错配有一定规律，以引物3'端A影响最大，因此，尽量避免在引物3'端第一位堿基是A 。引物3'端也不要是编码密码子的第三个堿基，以免因为密码子第3位简并性而影响扩增特异性。⑧引物5'端可以修饰，包括加酶切位点，用生物素、荧光物质、地高辛等标记，引入突变位点，引入启动子序列，引入蛋白质结合DNA序列等，引物的设计最好以电脑软件进行指导。
反应体系中，引物浓度一般要求在O.10.5μmol之间。浓度太高，容易生成引物二聚体，或非特异性产物。
引物Tm值与退火温度有关，计算公式为：Tm4（G+C）+2（A+T）。引物Tm值最好在5580℃范围，以接近72℃为最好。
（三）耐热的TaqDNA聚合酶
1976年Chien分离出热稳定聚合酶，1986年Erlich分离并纯化了适于PCR的Tq热稳定性聚合酶，为PCR成为实用技术奠定了基础，现已用基因重组生产。日前可用于PCR的聚合酶有多种：有从水生栖热菌中提取的Taq酶、从嗜热栖热苗中获得的Taq酶、从Litoralis栖热球菌中分离的VENT酶、及从酸热浴硫化裂片苗中分离的Sac酶，而以Taq酶用得最广泛。Taq DNA聚合酶分子量为94kD，75℃时酶比活性为150bs/酶分子，反应温度过高或过低均影响其延伸率，Taq蕾有很高的耐热稳定性。实验表明，在92.5℃、95℃、97.5℃时，其半衰期分别为40min、30min和5min 。

聚合酶链式反应的英文缩写是 聚合酶链式反应( 三 )

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